1. Висновки.

Вступ.

Конфокальний мікроскоп відрізняється від "класичного" оптичного мікроскопа (див. пункт 3.1 ) Тим, що в кожен момент часу реєструється зображення однієї точки об'єкта, а повноцінне зображення будується шляхом сканування (руху зразка або перебудови оптичної системи). Для того, щоб реєструвати світло тільки від однієї точки після об'єктивної лінзи розташовується діафрагма малого розміру таким чином, що світло, що випускається аналізованої точкою (червоні промені на рис. 1б), проходить через діафрагму і буде зареєстрований, а світло від інших точок (наприклад, сині промені на рис. 1б) в основному затримується діафрагмою. Друга особливість полягає в тому, що освітлювач створює не рівномірну освітленість поля зору, а фокусує світло в аналізовану точку (рис. 1в). Це може досягатися розташуванням другий фокусує системи за зразком, але при цьому потрібно, щоб зразок був прозорим. Крім того, об'єктивні лінзи зазвичай порівняно дорогі, тому використання другої фокусує системи для підсвічування мало переважно. Альтернативою є використання светоделітельной пластинки, так щоб і падаючий і відбитий світло фокусувалися одним об'єктивом (рис. 1г). Така схема до того ж полегшує юстування.

Мал. 1а. Хід променів в звичайному оптичному мікроскопі, коли в фотоприемное пристрій потрапляє світло з різних точок зразка.

Мал. 1б. Застосування діафрагми дозволяє істотно знизити фонову підсвічування від точок зразка поза аналізованої області.

Мал. 1в. Додаткове підвищення контрасту досягається застосуванням підсвічування, котра фокусує світло в аналізовану точку.

Мал. 1г. Схема зі светоделітельной платівкою спрощує конструкцію мікроскопа і процес юстирування за рахунок подвійного використання об'єктива
(для підсвічування і збору відбитого сигналу).

Якісно зрозуміло, що застосування конфокальної схеми повинно призводити до збільшення контрастності зображення, за рахунок того, що "паразитний" світло від точок сусідніх з аналізованої перестає потрапляти в детектор. Платою за збільшення контрастності буде необхідність застосування досить складних схем сканування або зразком, або світловим пучком. Детальний розгляд існуючих технічних рішень побудови конфокальної мікроскопів виходить за рамки даного розділу. Подробиці з цього питання можна знайти в оглядах [1-11].

Дозвіл і контрастність в конфокальному мікроскопі.

Розглянемо тепер математично, яким чином і наскільки кількісно змінюється контрастність при застосуванні конфокальної мікроскопії. По-перше, тому що в конфокальному мікроскопі світло двічі проходить через об'єктив, то функція розмиття точки (далі позначається PSF, см. визначення в попередньому пункті 3.1 ) має вид

(1)

Для якісного розуміння зручно розглядати кожну PSF як ймовірність того, що фотон потрапить в точку з координатами , Або що фотон буде зареєстрований з точки з координатами , Тоді конфокальна PSF є твір незалежних ймовірностей. На рис. 2 наведено зображення звичайної PSF і конфокальної PSF.

Якщо використовувати критерій Релея для дозволу (провал 26% від максимуму розподілу), то ми отримаємо, що дозвіл в конфокальному мікроскопі збільшується, але не суттєво. Для конфокального мікроскопа

(2)

в той час як для звичайного мікроскопа

(3)

де .

Однак основною перевагою конфокального мікроскопа є не збільшення дозволу в сенсі критерію Релея, а істотне збільшення контрастності. Зокрема для звичайної PSF в фокальній площині відношення амплітуди в першому бічному максимумі до амплітуди в центрі становить 2%, для випадку конфокального мікроскопа це відношення буде 0.04%. На рис. 3 наведено практичний приклад, коли це важливо. На верхній частині малюнка ми бачимо, що тьмяний об'єкт (інтенсивність в 200 разів менше, ніж у яскравого) неможливо виявити в звичайний мікроскоп, хоча відстань між об'єктами істотно більше того, що наказано критерієм Релея. У той же самий час, в конфокальний мікроскоп (нижня частина малюнка 3) даний об'єкт повинен добре реєструватися.

Мал. 3. Розподіл інтенсивності для випадку звичайного мікроскопа (верхній малюнок) і конфокального мікроскопа (нижній малюнок).
Максимум інтенсивності тьмяного об'єкта в 200 разів менше, ніж інтенсивність яскравого [1].

Розподіл інтенсивності вздовж оптичної осі для конфокального мікроскопа визначається виразом

(4)

Тоді користуючись критерієм Релея отримаємо дозвіл уздовж оптичної осі

(5)

Тут важливо відзначити, що не слід плутати дозвіл уздовж оптичної осі і глибину фокуса в звичайному мікроскопі. Зазвичай глибина фокуса в сотні разів перевищує дозвіл уздовж оптичної осі.

Вплив діафрагми в фокальній площині.

Один з параметрів, який ніяк не фігурував у даному вище описі - це розмір діафрагм в фокальній площині опромінюючої і щороку збирає лінз. Відзначимо, що при аналізі ми мовчазно припускали джерело точковим і саме в цьому припущенні отримали функцію розмиття точки (PSF) для звичайного і конфокального мікроскопа. Отримані PSF описують властивості об'єктивної лінзи, а зображення діафрагми в площині об'єкта визначає, світло з яких областей реєструється фотодетектором. Очевидно, однак, що зменшення розміру діафрагми призводить до зменшення кількості світла, що проходить, збільшує рівень шуму і, в кінцевому підсумку, може звести нанівець всі досягнуті переваги по контрастності. Таким чином, постає питання про оптимальний вибір розміру діафрагми і розумному компромісі.

Діафрагма з отвором менше розміру плями Ейрі просто призводить до втрати інтенсивності і ніяк не впливає на дозвіл. Діафрагма розміром в одну пляму Ейрі дозволяє по максимуму використовувати роздільну здатність об'єктивної лінзи. Однак розмір діафрагми приблизно в 3-5 рази більше плями Ейрі представляється найбільш підходящим компромісом. Слід розуміти, що обговорюваний тут розмір має сенс розміру зображення в площині об'єкта, а тому реальний розмір отвору в діафрагмі залежить від збільшення лінзи. Зокрема, при використанні 100-кратної лінзи діафрагма з отвором 1 мм буде спроектована в площину об'єкта в коло радіусом 10 мкм.

Для того, щоб врахувати наявність діафрагми математично і побудувати нову функцію розподілу інтенсивності, слід виконати згортку

(6)

а для конфокального мікроскопа вже отриману функцію множити на . Результуючий розподіл інтенсивності для випадку діафрагми з розміром 5 плям Ейрі наведено на рис. 4.

Мал. 4. Функції розмиття точки для звичайного мікроскопа з діафрагмою розміром 5 плям Ейрі (верхні малюнки)
і для конфокального мікроскопа (нижні малюнки) [1].

Висновки.

• Конфокальна мікроскопія забезпечує збільшення контрасту зображення за рахунок застосування підсвічування сфокусованої об'єктивної лінзою в область аналізу та розміщення діафрагми в площині спостереження перед фотодетектором. Таке збільшення контрастності призводить до можливості дозволу об'єктів, що мають різницю в інтенсивності до 200: 1.
• У конфокальної мікроскопії дещо покращується дозвіл в площині об'єкта (в 1.5 рази) і досягається висока роздільна здатність уздовж оптичної осі.
• Платою за отримані поліпшення є необхідність застосування схем сканування, або шляхом переміщення зразка, або шляхом перебудови оптичної системи. Застосування сканування дозволяє збільшити поле зору в порівнянні зі звичайними оптичними мікроскопами.

Література.

1. Robert H. Webb "Confocal optical microscopy" Rep. Prog. Phys. 59 (1996) 427-471.
2. Richards B. and Wolf E. "Electromagnetic diffraction in optical systems II. Structure of the image field in an aplanatic system" Proc. R. Soc. A 253 (1959) 358-379.
3. Kino GS and Corle TR, 1989 Confocal scanning optical microscopy Phys. Today 42 55-62.
4. Pawley 1991 JB Fundamental and practical limits in confocal light microscopy Scanning 13 184-98.
5. Shotton D., (ed) 1993 Electronic Light Microscopy-Techniques in Modern Biomedical Microscopy (Wiley-Liss) p. 351.
6. Slater EM and Slater HS, 1993 Light and Electron Microscopy (Cambridge: Cambridge University Press).
7. Stevens JK, Mills LR and Trogadis J. (eds) 1993 Three-Dimensional Confocal Microscopy (San Diego, CA: Academic).
8. Webb RH, 1991 Confocal microscopes Opt. Photon. News 2 8-13.
9. Wilson T. тисяча дев'ятсот вісімдесят п'ять Scanning optical microscopy Scanning 7 79-87.
10. Wilson T. (ed) 1990 Confocal Microscopy (London: Academic).
11. Wilson T. and Sheppard CJR 1984 Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy (London: Academic).